Idag, låt oss prata om problemet som har orsakat otaliga forskningskollegor huvudvärk - Western blot (WB) experiment. Detta till synes enkelt men fulla av "fällor" -experiment, varför får det oss alltid att snubbla om och om igen? Låt oss nu granska orsakerna till misslyckanden tillsammans.
I. Inga band
Möjliga skäl kan inkludera:
- Antikroppsproblem: Antikroppen kan vara ineffektiv, ospecifik eller inte bindande till målproteinet.
- Exempelproblem: Provet kan innehålla störande ämnen, vara för låg i koncentration eller har redan försämrats.
- Elektroforesproblem: olämpliga elektroforesförhållanden, såsom spänning, tid eller felaktig användning av buffert.
- Överföringsproblem: Problem under överföringsprocessen, såsom olämpligt membranval, överföringstid eller överföringsbuffert.
- Blockeringsproblem: Blockeringslösningen kan vara olämplig eller blockeringstiden kan vara för lång.
- Färgningsfrågor: Färgningsreagenset kan löpa ut, okänsligt eller felaktigt använda.
Utrustningsproblem: Utrustningen kan fungera eller inte kalibreras korrekt.
- Problem med experimentella drift: Den experimentella operationen kanske inte är standardiserad, såsom otillräcklig tvätt eller ojämn provbelastning.
- Problem med proteinmodifiering: Målproteinet kan genomgå modifieringar efter translationella som förhindrar antikroppsigenkänning.
- Målproteinuttrycksproblem: Målproteinet kan ha mycket lågt uttryck eller inget uttryck i cellerna eller vävnaderna som upptäcks.
Ii. Hög bakgrund
Möjliga skäl kan inkludera:
- Hög antikroppskoncentration: Att använda för mycket antikropp kan öka ospecifik bindning, vilket resulterar i hög bakgrund.
- Problem med antikroppskvalitet: Antikroppen kan ha hög ospecifik bindning eller korsreaktion med andra proteiner.
- Otillräcklig blockering: Blockeringslösningen täcker inte effektivt ospecifika bindningsställen på membranet, vilket resulterar i hög bakgrund.
- Membranproblem: Membranet kan ha dålig kvalitet eller förorening, vilket leder till hög bakgrund.
- Ofullständig överföring: Under överföringsprocessen får proteiner inte överföras helt till membranet, vilket resulterar i hög bakgrund.
- Otillräcklig tvätt: Tvättstegen misslyckas med att effektivt ta bort obundet antikropp eller andra föroreningar, vilket leder till hög bakgrund.
- Färgningsreagensproblem: Färgningsreagenset kan vara för känsligt eller instabilt, vilket resulterar i hög bakgrund.
- Problem med experimentell utrustning: Utrustningen kan ha läckage eller störningar, vilket leder till hög bakgrund.
- Problem med proteinprov: Provet kan innehålla en stor mängd störande ämnen, såsom proteinnedbrytningsprodukter eller andra föroreningar.
- Problem med experimentella drift: Den experimentella operationen kanske inte är standardiserad, såsom långvarig inkubationstid eller hög temperatur.
Iii. Ospecifika band eller felaktiga proteinbandstorlekar
Möjliga skäl kan inkludera:
- Alltför många passager av celler, vilket resulterar i olika proteinuttrycksnivåer, vilket leder till inkonsekventa bandstorlekar eller närvaron av flera band.
- Proteinprovnedbrytning, vilket resulterar i lägre proteinmolekylvikt eller närvaro av flera band.
- In vivo -uttryckt proteinprover kan ha olika former av modifieringar såsom acetylering, metylering, alkylering, fosforylering och glykosylering, vilket leder till inkonsekventa bandstorlekar eller närvaro av flera band.
- Målproteinet innehåller flera isoformer eller skarvvarianter, vilket resulterar i inkonsekventa bandstorlekar eller närvaron av flera band.
